Técnica de edición genómica en la neumonía

TEMA: Polimorfismos de los genes "FER Y FoxO3": papel en la susceptibilidad, gravedad y pronóstico de la neumonía adquirida en la comunidad

FOXO3 y FER son determinantes genéticos de la respuesta del huésped a la infección que desempeñan un papel en la susceptibilidad a la neumonía, en el desarrollo de formas más graves de la misma y en su evolución. Su estudio contribuye a superar las limitaciones de los actuales modelos clínicos de predicción de riesgo en la neumonía adquirida en la comunidad.

Para lo cual se estudiaron diferentes grupos de pacientes con NAC para determinar los polimorfismos en los genes mencionados.

Para el gen FER, se estudian dos polimorfismos, rs4957796 (cromosoma 5:109066439T>C) y rs62375529 (cromosoma 5: 109081631T>C), ambos intrónicos y en alto desequilibrio de ligamiento (D´=1 y r2= 0´8), mientras que para el gen FOXO3 el estudio se centró en un SNP sinónimo (no codificante) también intrónico en FOXO3A denominado rs12212067 (cromosoma 6: 108981196T>G).

Pese a que este estudio aun no ha sido llevado a la práctica vale la pena mencionarlo por las siguientes razones:

1.- El estudio de los genes ayudará a identificar vías patogénicas y descubrir las bases moleculares de la respuesta a los fármacos (farmacogenética)

2.- Los genes pueden representar, en un futuro próximo, una diana en el tratamiento (terapia génica).

Referencia bibliográfica:

1.Valencia-Gallardo J. Polimorfismos de los genes "FER Y FoxO3": papel en la susceptibilidad, gravedad y pronóstico de la neumonía adquirida en la comunidad [Internet]. Hdl.handle.net. 2016 [cited 24 December 2017]. Available from: http://hdl.handle.net/10553/18427

Stem cells en la neumonía

Tema: Las células madre mesenquimales mejoran la supervivencia y el aclaramiento bacteriano en la neumonía murina de Escherichia coli.

Tipo de Stem Cell: Las células madre mesenquimales (MSC),multipotentes aisladas de la médula ósea.

Método de obtención: Los macrófagos alveolares se aislaron de ratones C57BL / 6 normales mediante lavado broncoalveolar (BAL) usando PBS libre de calcio y magnesio suplementado con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,6 mM. Las células se sembraron en placas y se estimularon con LPS (± MSC en un transwell) o con medio acondicionado obtenido a partir de MSC estimuladas con LPS. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron mediante ELISA 

Resultados: El tratamiento con MSCs mejoró la supervivencia y el aclaramiento bacteriano en un modelo murino de neumonía Gram negativa. El efecto del aclaramiento bacteriano se debió, en parte, a la regulación al alza de la producción de lipocalina 2 por las MSC.

Referencias Bibliográficas:

1. Gupta N, Mouded M, Tan X. Las células madre mesenquimales mejoran la supervivencia y el aclaramiento de bacterias en murino Escherichia coli neumonía. (actualizado en 2014; acceso el 08 de Junio de 2017) Disponible en: https://thorax.bmj.com/thoraxjnl-2011-201176

ADN recombinante en la naturaleza y el la Neumonía

ADN recombinante en la naturaleza 

Tema: Ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante

Objetivo: Hoy es posible crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de restricción y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e inserirla en el ADN de otro. Las formas vivas que han sufrido tal transformación y que contienen un ADN extraño son llamadas transgénicas.

Gen: Gen tet y Gen amp

Enzima de restricción: Pstl, BamHI, Sall

Enzima ligasa: No especifica cual es pero si existe una.

Vector: Tipo cósmido es un vector híbrido entre un plásmido, que proporciona la resistencia a los antibióticos, y una región del ADN de un bacteriófago llamada "cos" que le otorga sus particulares características.

Célula receptora: Célula bacteriana

Método de inserción del gen: Transformación

Método de identificación: Electroforesis

ADN recombinante en la Neumonía

Tema: Clonación y expresión heteróloga de un potencial candidato vacunal contra neumonía en alpacas usando el enfoque pan - genómico de la vacunación reversa.

Objetivo: Obtener en E. coli un candidato vacunal recombinante para evitar neumonía en alpacas.

Gen: IktA 2856pb

Enzima de restricción: Pstl

Enzima ligasa: ADN ligasa T4 ligasas

Vector: pET102 (10000 pb y 7000 pb)

Célula receptora: E. coli (procariota), plásmido.

Método de inserción del gen: transformación

Método de identificación:  Análisis de la proteína, LktA recombinante

Referencias Bibliográficas:

1.Società Scientifica di Nutrizione Vegetariana.  Ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante (actualizado 29 de Julio de 2015; acceso el 26 de Mayo de 2017) Disponible en:https://ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html

2. Universidad Nacional Mayor De San Marcos. Clonación y expresión heteróloga de un potencial candidato vacunal contra neumonía en alpacas usando el enfoque pan-genómico de la vacunología reversa [Internet]. Cybertesis. 2017 [cited 24 December 2017]. Available from: http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/5823/2/Juscamayta_lj.pdf

Microarray en Neumonía

Tema: Desarrollo de un nuevo ensayo basado en microarrays de resecuenciación de patógenos para la detección de virus del tracto respiratorio de amplio espectro en pacientes con neumonía adquirida en la comunidad.

Objetivo: Desarrollar y optimizar una nueva RPM (RPM-IVDC1) que consistía en mosaicos de detector de 224 pb correspondientes a 9 subtipos de influenza A, 11 rinovirus, 28 enterovirus y otros 38 virus respiratorios para proporcionar sensibilidades de detección individuales y simultáneas que van desde 15 a 750 copias genómicas para 16 patógenos respiratorios comunes.

Muestra: Aspirados nasofaríngeos

Tipo de ácido nucleico extraído: ARN total

Extracción de ADN

Amplificación: a partir del genoma completo

Purificación: QIAquick Kit de purificación de PCR (QIAGEN, Hilden, Alemania)

Los productos purificados se ligaron al vector pGEM-T (Promega, Madison, WI) y los plásmidos recombinantes se transformaron en E. coli.

El plásmido recombinante de TIM se linealizó con Spe I ytranscrito in vitro a partir del promotor T7 usando el sistema de producción de ARN a gran escala Ribo-MAX ™ T7 (Promega, Madison, WI).

Genes a amplificar: RPM-IVDC1

Tipo de prueba: Microarrays de ADN

Pasos

Purificación: QIAquick Kit de purificación de PCR

Hibridación: 49 ° C durante 16 h.

Numero de ciclos: GeXP 

Referencias Bibliográficas 

1. Shen H, Shi W, Wang J, Wang M, Li J, Zhang C et al. Development of a New Resequencing Pathogen Microarray Based Assay for Detection of Broad-Spectrum Respiratory Tract Viruses in Patients with Community-Acquired Pneumonia. PLoS ONE [Internet]. 2013 [cited 3 December 2017];8(9):e75704. Available from: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0075704

PCR en la Neumonía

Tema: Comparación de muestras de esputo y muestras de aspirina nasofaríngea y de los objetivos de genes de PCR lytA y Spn9802 para PCR cuantitativa para la detección rápida de neumonía neumocócica.

Objetivo: Comparar las muestras de esputo y aspirado nasofaríngeo (NpA) y el gen de PCR se dirige a lytA y Spn9802 en ensayos de PCR cuantitativa (qPCR) para la detección rápida de la etiología neumocócica en la neumonía adquirida en la comunidad (NAC).

Muestra: Esputo y hemocultivo

Tipo de ácido nucleico que será extraído: ADN

Extracción de ADN

• Lisis: Kit de Aislamiento de Ácido Nucleico I MagNAPure Compact con un robot MagNAPure Compact (Roche Diagnostics , Mannheim, Alemania), con aproximadamente 5 minutos de tiempo práctico por muestra.
• Purificación: Kit I MagNAPure Compact.
• Separación: Kit I MagNAPure Compact.

Genes a amplificar: lytA y Spn9802.

Números de pares de bases: 352 pares de bases en M. pneumoniae, 333 pares de bases en C. pneumoniae y 233 pares de bases en L. pneumophila.

Tipo de PCR: PCR cuantitativa (qPCR).

Visualización: Electroforesis.

• Desnaturalización: Técnica de Mejuto y colaboradores.
• Hibridación: LightCycler FastStart sondas de hibridación.
• Extensión: Técnica de Mejuto y colaboradores.
• Número de ciclos: Técnica de Mejuto y colaboradores.

Referencias bibliográficas

1.Stralin K, Herrmann B, Abdeldaim G, Olcen P, Holmberg H, Molling P. Comparison of Sputum and Nasopharyngeal Aspirate Samples and of the PCR Gene Targets lytA and Spn9802 for Quantitative PCR for Rapid Detection of Pneumococcal Pneumonia. Journal of Clinical Microbiology [Internet]. 2013 [cited 3 December 2017];52(1):83-89. Available from: http://jcm.asm.org/content/52/1/83.full

Prueba de tamizaje y pruebas confirmatorias para el diagnóstico de neumonía

PRUEBA DE TAMIZAJE

La prueba de tamizaje en el caso de la neumonía sería una radiografía de tórax siendo esta la más segura en cuanto a precisión, pero también tenemos otras técnicas como medir los signos de la neumonía (dificultad de respirar, respiración acelerada) y otras técnicas más simples como la auscultación, las cuales estaría de más explicarlas. (Aun así dejo estos links para entender las técnicas mencionadas.) 1 2.

                       

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

Una prueba confirmatoria es aquella que debe ser enviada solo en caso de sospecha de una enfermedad para como su nombre lo indica confirmar las sospechas en este caso de la neumonía.

Entre las pruebas confirmatorias tenemos

La proteína Creactiva y la velocidad de sedimentación globular (VSG): son marcadores de inflamación poco específicos para confirmar la etiología de una neumonía, las neumonías bacterianas típicas suelen presentar proteína C reactiva elevada, mientras que las atípicas y las virales suelen cursar sin alteración de la misma.

Niveles deprocalcitonina (PCT): una prohormona de la calcitonina que en algunos estudios ha demostrado tener buena sensibilidad, especificidad y valor predictivo para distinguir entre infecciones bacterianas y virales.

Hemocultivo y  cultivo de esputo: Los principales agentes bacterianos que se asocian con la neumonía son Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, y Klebsiella pneumoniae. Al igual se puede realizar un cultivo de líquido pleural si hay presencia de rodeando a los pulmones. También se puede hacer una tinción de Gram y cultivo de esputo para buscar estas bacterias o virus que están causando los síntomas.  

                                      

Gasometría arterial: se utiliza para determinar si la cantidad de sangre que llega a los pulmones es la necesaria.

                                    

 VIDEO 

                                        

Referencias bibliográficas:

1.Domecq J, Prutsky G, Lazo M, Salazar C, Montori V, Prevost Y et al. Precisión de la taquipnea y las retracciones subcostales como signos clínicos para diagnóstico de neumonía adquirida en la comunidad en niños: revisión sistemática y metaanálisis [Internet]. Scielo.org.pe. 2012 [cited 19 November 2017]. Available from: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1726-46342012000300007&script=sci_arttext

2.Toledo Rodríguez I, Toledo Marrero M. Neumonía adquirida en la comunidad en niños y adolescentes [Internet]. Scielo.sld.cu. 2012 [cited 19 November 2017]. Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-21252012000400014&script=sci_arttext&tlng=pt

3.Arguedas A, Abdelnour A, Soley C, Jimenez E, Jimenez A, Ramcharran D et al. Prospective epidemiologic surveillance of invasive pneumococcal disease and pneumonia in children in San José, Costa Rica [Internet]. Scielo.sa.cr. 2012 [cited 19 November 2017]. Available from: http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0001-60022012000400009&script=sci_arttext

3.Martínez R, Lisvania M, Adolfo G, Espinoza O. Streptococcus pneumoniae - Repositorio UNAN-Managua [Internet]. Repositorio.unan.edu.ni. 2015 [cited 19 November 2017]. Available from: http://repositorio.unan.edu.ni/id/eprint/1035

4.Ruidos respiratorios: MedlinePlus enciclopedia médica [Internet]. Medlineplus.gov. 2017 [cited 19 November 2017]. Available from: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/007535.htm

5.Begoña J, Calvo C, Meseguer Peinado M, Palomo A, Puig de la Bellacasa J. Cite a Website - Cite This For Me [Internet]. Seimc.org. 2013 [cited 19 November 2017]. Available from: https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia25.pdf